Abstract
磷酸丙糖異構酶在醣解作用及糖質新生反應路徑中催化磷酸二羥丙酮磷酸鹽和D-甘醛3-磷酸鹽間同質異構化的轉換。本研究中幽門螺旋桿菌的磷酸丙糖異構酶被大量表現以及純化，並利用X光晶體繞射實驗來決定其立體結構，進而了解其生物功能特性。經由酵素活性分析結果顯示幽門螺旋桿菌磷酸丙糖異構酶在以二羥丙酮磷酸鹽為受質時，Km為3.46 ± 0.23 mM 而 kcat為8.8 x 104 min-1。其晶體結構是以分子置換法解析，所得之最高解析度是2.3埃。幽門螺旋桿菌磷酸丙糖異構酶的晶體結構是由八個摺板環狀形成桶狀結構外圍包覆七個螺旋體所組成，此結構相似於一般由八組重複的摺板/螺旋形成的桶狀結構 (TIM barrel)，但是缺乏位於第二個摺板C端的螺旋體。經由環形六的構形以及活化區結合著磷酸根離子的現象，推測幽門螺旋桿菌磷酸丙糖異構酶的晶體結構是處在閉鎖的狀態。大多數磷酸丙糖異構酶具有一個由精氨酸及來自 “DX(D/N)G” 特定區域的天門冬氨酸所形成的高度保留性鹽橋，而在幽門螺旋桿菌磷酸丙糖異構酶中， “211SVDG214” 區域取代了 “DX(D/N)G” 特定區域，因此該高度保留性鹽橋並不存在。為了探討此高度保留性鹽橋對於幽門螺旋桿菌磷酸丙糖異構酶的重要性，本研究構築並純化四個突變株蛋白- K183S、K183A、D213Q、D213S並針對這四個蛋白做功能特性的分析。經由酵素動力學的結果顯示，精氨酸/天門冬氨酸所形成的保留性鹽橋對於幽門螺旋桿菌磷酸丙糖異構酶的酵素活性並不是必需的，但是對於幽門螺旋桿菌磷酸丙糖異構酶的構形穩定度可能有相當程度的貢獻性。 羧基去亞精胺脫羧酶隸屬於第四群磷酸吡哆醛依賴型脫羧酶。羧基去亞精胺脫羧酶在替代性多元胺之生合成路徑中催化羧基去亞精胺的脫羧作用，進而產生去亞精胺 (norspermidine)。輔酶磷酸吡哆醛與一個來自磷酸吡哆醛依賴型脫羧酶活化區的離氨酸殘基以共價鍵結方式形成希夫鹼 (Schiff base)。本研究中幽門螺旋桿菌之羧基去亞精胺脫羧酶被大量表現並且以含有內生性磷酸吡哆醛的形式純化，並利用X光晶體繞射實驗來決定其立體結構，進而了解其生物功能。圓二色光譜及紫外光/可見光光譜的分析顯示去亞精胺能有效地取代離氨酸殘基並且與磷酸吡哆醛結合。其晶體結構是以多波長非尋常散射法解析，所得到的最高解析度是2.1埃。幽門螺旋桿菌羧基去亞精胺脫羧酶在水溶液中是以二聚體為作用形式，而在晶體結構中則以頭尾相接形式形成二聚體。晶體結構顯示其單元體是由N端磷酸丙醣異構酶相似的摺疊螺旋桶區、及C端摺疊桶區所組成。活化區則由一個特異性元件 (α10) 及一個活化環所組成 (loop β6α6)，而離氨酸殘基42與磷酸吡哆醛形成共價鍵結。為了容納較長的受質羧基去亞精胺，特異性元件位於一個相對於磷酸吡哆醛較為向後的位置。活化環則處於一個相當向下的構型，此特殊構型可能扮演避免位在活化區的受質或是產物曝露於溶劑中的角色。