Abstract
第一部份：建立精子和卵子間kinase的資料庫並尋找新的protein kinase 及其功能之研究 我們利用degenerated primer結合RT-PCR的方式來研究精子與卵子內 kinase的種類，進而 來探討減數分裂和受精過程中信號調控的機 制。在我們所建立的kinase資料庫中，總共 包含有41種 kinase，其中16種存在於精子而有31種存在於卵子。部份kinase在減數分 裂和 受精過程中已被報告扮演著重要的角色，顯示利用此種方 式來建立資料庫是可行的， 至於其它仍未知在這些過程中 可能功能的kinase在論文中有初步的探討。此外我們共發 現 了6種新的kinase，其中一個新的kinase命名為AIE1，將做更深入的研究 。AIE1含有282個 amino acids，其基因結構可分為三部份：很短 的N端(15 a. a.)、C端(16 a. a.)、和kinase catalytic domain(251 a. a.)，此結構類似於Cdc2。經由序列比對顯示和fly的 aurora、yeast的 Ipl1、及frog的Eg2類似(所以稱為AIE1)，此類基因與 細胞centrosome或chromosome的分離 有關。我們同時在human的 cDNA library篩選出與AIE1類似的基因 AIE2，經由northern blot 的分析，發現AIE1/2只專一的表現在睪丸(testis)。在老鼠的系統尚有兩 個AIE-related的 kinases存在，稱為STK-1與IAK1/ Ayk1也存在 於卵子內，其與AIE1在kinase catalytic domain 的相似性分別 為77.6%和66.3%。為了研究它們彼此間的差異，我們取出生後不同天數老 鼠的testis和cell line來做分析，顯示AIE1只存在於testis且不表現在 任何cell line，與其它二 者的表現型態不一樣。此外AIE1在testis的表 現方式與減數分裂細胞大量產生的時間一致 ，說明AIE1可能參 與在減數分裂的過程中，然而它的實際功能仍在研究中。在in vitro kinase的活性分析，顯示AIE1有自我磷酸化的現象，其活性受細胞內未知 的因子(factor) 來活化，此外尚可磷酸化細胞內一個p16的蛋白 ，AIE1可能之功能與調控方式在論文內 有較深入的探討。 第二部份：水稻懸浮細胞在缺糖下基因表現的探討 為了探討水稻細胞在缺糖下的調控機制，我們利用mRNA differential display的方法來研 究水稻細胞在有糖及缺糖狀況下表現不一樣的 基因，我們共篩選到6個基因其中2個受 糖活化其餘4個受糖 抑制。經由GenBank的比對，大都為未知的基因，只有一個是已發 表的基因稱為salT，於是以salT為研究對象來探討缺糖的信號調控機制。 salT是一個受 高鹽處理後會大量表現的基因，在本實驗中發 現在缺糖狀況下也會大量表現，此外在 其它的逆境下它也 會表現，顯示salT在植物克服逆境過程中有不可或缺的功能。在不 同糖的analog(2-DG和3-OMG)處理下，顯示在水稻細胞內感應糖分子有無 存在的信號是 透過hexokinase來感測。而在後續的信號調控 方面，Ca+2會活化salT基因的表現，處理 Ca+2的抑制劑La+3 則會抑制salT在缺糖下的表現。此外處理W7(Calmodulin和Ca+2 dependent protein kinase的抑制劑)也會抑制salT在缺糖下的表現，而 其它kinase的抑制劑則 沒有影響。綜合以上結果說明在salT的缺糖信 號調控方面，有一個受Ca+2調控的protein kinase參與在此反 應中來調控細胞在缺糖下salT基因的活化或抑制。