Abstract
核酸銜接酵素是反轉錄病毒感染史中不可欠缺的一種蛋白。其在反轉錄病毒之生活史中所扮演的角色為將反轉錄酵素所反轉錄之 cDNA 銜接至寄主細胞的基因組中，然後反轉錄病毒才得以進行其感染複製史。至今，較被了解的作用機制大多是在細胞外in vitro) 之實驗推測而來。從歷年來對 HIV-1 之核酸銜接酵素的研究可知其銜接功能可大致分為二個步驟：首先，核酸銜接酵素會與病毒端邊的 DNA 結合形成銜接體，將病毒 DNA 的3' 端移除 2 個核□酸，此步驟常被稱為 3' 端剪切作用或端邊剪切作用；然後此新產生的病毒 cDNA 的 3' OH 端被銜接到標的 DNA，此步驟稱為 DNA 股轉移作用。此兩步驟在細胞外，似乎不需任何其他病毒的或細胞的蛋白質參與協助，即可由核酸銜接酵素單獨完成任務。然而核酸銜接酵素是將病毒的 cDNA 銜接至寄主細胞染色體的何處，至今尚不十分清楚。在細胞外實驗之結果顯示可能是隨機的將病毒的 cDNA 銜接至標的 DNA 中，並沒有DNA 序列的專一性；但有些實驗則顯示可能與 DNA 的構形或被修飾過的 DNA 或其他蛋白質結合區域有關。 核酸銜接酵素是否在細胞內會受病毒的其他分子所影響，目前所知並不十分清楚。在本篇論文中，我們證明了在細胞內，缺乏任何 HIV-1 的蛋白時，表現之 HIV-1 核酸銜接酵素能夠單獨將 MLV 之完整基因銜接至寄主細胞之基因組中。首先我們將具感染能力的原形病毒載體 MLV-K 之核酸銜接酵素做部分切除，再分別在 MLV LTR 之 3’ 和 5’ 端做定點突變，使其能夠成為 HIV-1 核酸銜接酵素之受質 DNA。將這些載體轉化感染已被具有 HIV-1 核酸銜接酵素基因的 pXT1-IN 載體所轉化感染過而能持續表現 HIV-1 核酸銜接酵素的 NIH/3T3 細胞。再以非放射性的反轉錄酵素活性測試的方法偵測病毒之釋出。另外以 PCR 分析法偵測出是否這些基因已被銜接至細胞的基因組中。我們發現在細胞內的狀況下，缺乏任何 HIV-1 的病毒蛋白時，HIV-1 之核酸銜接酵素能夠單獨行使核酸銜接之反應而將 MLV 之完整基因 DNA 銜接至寄主細胞之基因組中。 核酸銜接酵素能夠將受質 DNA 銜接至標的 DNA，因此以反轉錄病毒做為基因傳遞的系統將被廣泛的應用在基因治療上。但是野生型的反轉錄病毒核酸銜接並無基因序列的專一性，這種應用之結果可能導致不正常的活化或者阻斷一些正常基因的表現而產生致癌等病變。為了儘可能的將受質基因銜接或傳遞至預先設定的基因位置，我們嚐試發展以反轉錄病毒所衍生出的系統，將老鼠白血病病毒之核酸銜接酵素與 Sp1 DNA 結合區位表現形成融合蛋白。此融合蛋白之 Sp1 鋅手指區位基因被接在完整的核酸銜接酵素之 C 端，所建構出之載體 (pMIN-Sp1) 與野生型之病毒載體 (pMLV-K) 共同轉化感染 NIH/3T3 細胞，然後收集所產生的病毒，再將這些病毒感染 3T3 細胞。經由實驗證明基因重組之病毒基因可以被銜接至寄主細胞的基因組中，並且能表現出重組融合蛋白之 mRNA。將這些被重組病毒感染的細胞基因組抽出，以限制酵素分解，以 TA 選殖之方式選殖至 pCRII-TOPO 載體。這些載體隨後以 Sp1 引子與 LTR 上之引子做 PCR 反應篩選出可能具有 Sp1 位置的選殖株，最後將這些載體定序，結果發現在重組病毒組中有高達 12.5 % 之選殖株具有 Sp1 結合位置，而野生型病毒之感染組則沒有發現會標定至 Sp1 結合位置。將得到的序列分別以 NCBI GenBank Mouse EST 比對，則發現這些具有 Sp1 結合位置之選殖株的基因含有老鼠各種細胞之基因，而野生型組之序列則有 73.3% 沒有契合之基因被發現。