Abstract
氫氧自由基 (.OH) 是已知作用最強的含氧自由基，而且未曾發現特 異性酵素可直接中和其作用，是故針對氫氧自由基防禦系統的研究有助於 了解氧化性損傷與精子細胞功能異常的關係。過氧化氫可於溶液中存在鐵 離子時與之反應產生氫氧自由基，本實驗中過氧化氫的生成其ㄧ是利用黃 嘌呤氧化酉每 (xanthine oxidase)在有氧的情況下氧化黃嘌呤( xanthine)產生過氧化氫進而與二價鐵離子反應生成氫氧自由基，另ㄧ是 直接外加過氧化氫至反應液中。利用這兩個氫氧自由基合生系統與精子細 胞共同培養，我們觀察外加氫氧自由基對人類離體精子活動力 (motility, MOT)，平均軌跡速度(average path velocity, VAP) 等功能 性參數的影響，並以電腦輔助精液分析儀(computer-assisted semen analyzer, CASA)分析這些功能參數隨時間的變化。我們發現氫氧自由基 對精子細胞的活動力具有抑制效應。再者，我們對氫氧自由基如何造成精 子細胞功能喪失的可能機制作了進一步的探討。利用定量脂質過氧化( lipid peroxidation)之一種終產物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的生 成，我們探究外加氫氧自由基的濃度與精子細胞脂質過氧化物的含量之相 關性。分析的結果顯示精子細胞脂質過氧化的程度受到氫氧抄由基明顯的 促進，這個觀察提供了解釋氫氧自由基如何影響精子細胞功能的一個面向 。我們進一步觀察氫氧自由基對人類離體精子細胞 DNA 之氧化性傷害。 我們以高效液相層析法配合電化學特性檢測器定量遭氧化性傷害之鹼基含 量以作為量化 DNA 氧化性傷害的指標。我們測量氧化性鹼基 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OH-dG) 在各組實驗中的含量變化，藉 以得知DNA之氧化性傷害與氫氧自由基間之劑量關係。結果顯示 8-OH-dG 之百分率伴隨亞鐵離子濃度之升高而攀升，顯示氫氧自由基及其誘發之脂 質過氧化進一步造成精子細胞DNA 之傷害。利用氫氧自由基與精子細胞共 同培養後觀察外加氫氧自由基對人類離體精子細胞 mtDNA 的影響。利用 聚合酉每鏈鎖反應 (polymerase chain reaction) 的技術及南方墨漬 (Southern hybridization) 的方法，我們研究外加氫氧自由基與產生一 新發現的 mtDNA 7.5 kb 大幅斷損突變間之相關性。此 7.5 kb 大幅斷損 普遍存在精子細胞的 mtDNA 中，其存在的量佔全部 mtDNA 之比例與精子 細胞的活動呈負相關，而且伴隨亞鐵離子濃度之增加而升高的現象顯示此 大幅斷損受到氫氧自由基的作用後其比例有明顯的變化，顯示另一氧自由 基影響精子細胞功能之可能途徑，唯影響之範圍及程度尚待進一步研究。 依據實務的了解及需要，我們設計了閃光頻率同步計數儀及細胞共同培養 的系統，前者可作為追縱及度量單一精子細胞尾部擺動頻率以及篩選精子 之用，後者則根據活性氧分子(reactive oxygen species, ROS)之氧化性 傷害給予精子細胞必要之一層保護機制。將精子細胞與 Vero cells monolayer 共同培養，我們發現 Vero cells 不僅可以相當程度的維持精 子細胞的運動功能，甚至有能力抑制自發性脂質過氧化作用之發生。總結 上述結果，氫氧自由基造成精子細胞活動力下降、脂質過氧化、DNA氧化 性傷害以及mtDNA大幅斷損之比例升高，我們可藉由與Vero cells 共同培 養的方式有效地減低這些氧化性傷害，若能配合單一精子細胞篩選的技術 ，我們相信很有機會幫助男性不孕症的患者增加成功受孕的機會。