Abstract
心臟毒素是眼鏡蛇蛇毒的主要成份，它的三維結構為由雙硫鍵構成的基部 伸出5串beta-摺板組成的三個指狀環。一般認為它會作用於細胞膜上，過 去對結構與功能關聯的研究主要在帶正電的Lys, Arg胺基酸及芳香族 Trp, Tyr胺基酸，顯示活性與由正電胺基酸環繞的疏水性區塊有關。在這 篇報告中，我們利用核磁共振、圓二色光譜、及螢光技術，首度探討酸性 胺基酸所扮演的角色。我們以核磁共振方法決定出台灣眼鏡蛇心臟毒素 CTX A5的His-4, Glu-17, Asp-42, 及Asp-59的pKa分別是5.6, 4.0, 3.2及小於2.3，這使我們能夠分別探討個別胺基酸的角色。結果顯示雖然 整個毒素分子的整體三維結構在pH 7 ~ pH 2.5之間都非常相似，但是區 域性的結構變化卻會影響分子對脂質作用的活性，也影響分子的穩定性。 經由核磁共振化學位移的分析，His-4的質子化造成毒素Loop I附近及C端 附近區域性結構的變化，主要包括Loop I部份胺基酸支鏈的轉動，這個結 構變化及 His-4的質子化，影響了分子與脂質單層膜結合的能力。由圓二 色光譜分析，Glu-17及Asp-42質子化時分子的二維結構有些微穩定，但區 域性結構變化卻使毒素對細胞膜的活性完全消失，比較9種心臟毒素的胺 基酸序列及其受變性劑影響的忍受度，含有Glu-17的毒素的結構穩定性最 差。當Asp-59或C-端質子化時，毒素的結構不能維持 beta-摺板而變成不 規則盤繞。因此我們提出了在雙硫鍵不破壞時能翻轉心臟毒素的模型，可 能Glu-17是透過取代Asp-59來破壞由Asp-59與Lys-2所形成的鹽橋而影響 毒素結構穩定性。另外我們利用與結構非常有關的核磁共振化學位移來比 較了已由核磁共振解出水溶液結構的心臟毒素，發現心臟毒素結構不同的 部份是位於Loop I及Loop II的尖端，意外發現了心臟毒素A3的胺基酸認 定有若干錯誤，我們也作了修正。以螢光淬熄的方法，我們決定了心臟毒 素結合在帶負電的磷脂球時， Loop I的Trp (或Tyr)穿入細胞膜的深度大 約在脂肪酸碳鏈上第5個碳的位置，距極性表面約5埃，顯示其結合的方式 並不穿入細胞膜內。在這篇報告裡，我們對酸性胺基酸在心臟毒素的角色 有初步的了解，並建立了以核磁共振研究區域性結構的方法、以螢光淬熄 研究膜作用蛋白穿入膜深度的方法。這些方法，將有助於未來解決心臟毒 素的結構與膜活性功能關聯。