Abstract
金屬硫蛋白(metallothionein,簡稱 MT)是一種含高量 cysteine 且會與金屬結合的小分子量蛋白質.目前在哺乳動物發現的 MT isoforms 一共有四種:MT-I,MT-II,MT-III 及 MT-IV. 一般認為 MT-I 及 MT-II 主 要扮演金屬解毒的角色.MT-III 可能可避免神經細胞的 sprouting 及 類 似蛋白質沉澱物neurofibrillary tangles 的形成.目前MT-IV 的功能則 未知. 在此論文中我們主要探討金屬硫蛋白基因的表現.第一部份研究睪 丸細胞 MT-I 及 MT-II 基因的表現. 睪丸是一個對Cadmium (Cd) 金屬相 當敏感的組織.目前睪丸組織是否有 MT 及 MT 是否可因 Cd 的誘導而增 加仍備受爭議.在我們的研究中我們以小老鼠細胞株萊迪式(Leydig)及史 托利氏細胞株(Sertoli cell line)作為研究題材,分別從轉錄( transcription)及轉譯 (translation) 的層面探討睪丸組織 MT 基因的 表現. 首先我們以不同濃度的 Cd 處理細胞,確定 Cd 能在細胞內累積後, 我們先測試 MT 基因的轉錄因子(transcription factor)是否正常. 另外 也以北方雜合法 (Northern blot)了解 MTmRNA 的表現情形.結果顯示兩 種細胞中 MT 基因轉錄的機制是正常的,而且以 Cd或其它 MT 的誘導原處 理細胞後可誘導 MT mRNA 的表現.引子延展(primer extension)的結果顯 示細胞受誘導後所合成的 MT mRNA 是正常的.接著我們以 35S-cysteine 去標定新合成的蛋白質,證實睪丸細胞確實可以合成 MT 蛋白質.根據以上 的結果,我們證實睪丸細胞的 MT 基因是可受誘導而表現的. 第二部份我 們探討豬的 MT-III 基因在酵母菌的表現.MT-III又稱為生長抑制因子 (GIF)只會專一性的在腦部表現.MT-III具有其它 MTisoform 所沒有的抑 制神經細胞生長的功能. 為了了解MT-III結構與功能之間的關係,我們以 酵母菌 (Saccharomyce cerevisiae)系統表現MT-III 蛋白質. 首先將選 殖到的豬的 MT-III cDNA 接至表現載體. 表現載體上 MT-III基因表現的 結果使酵母菌宿主對金屬產生抗性.由酵母菌純化出的 MT-III 蛋白質經 質譜儀分析的結果,MT-III的分子量正確且第一個 methionine 有 acetylation 的修飾作用. 另外我們也分別比較 MT-II 與 MT-III 蛋白 質穩定性,金屬結合能力及 UV吸收圖譜的差異,結果顯示 MT-II 與MT-III 有相同的物理特性.為了得到大量的 MT-III蛋白質進行結構與功能的分 析,我們將原先的真核生物轉譯起始序列(eukaryotictranslation initiator sequence)以酵母菌的保留序列(yeast consensussequence)取 代.新建立的表現載體使酵母菌宿主 MT-III 蛋白質的表現提高.但 MT- IIImRNA的量並沒有增加. 因此我們推論新的表現系統具有較高的轉譯效 率因此提高 MT-III的產量. 我們以酵母菌表現系統純化所得的豬的MT- III 蛋白質進行 GIF 功能的分析.首先我們建立 primary neuron culture的系統去分析豬的 MT-III蛋白質是否具有抑制神經細胞生長的能 力.在此研究中我們以豬腦萃取液取代老年癡呆症(Alzheimer disease)病 人的腦萃取液, 結果顯示在豬腦萃取液的條件下豬的 MT-III 蛋白質無法 抑制神經的生長.我們推測在豬腦萃取液的條件下並不能進行 GIF活性的 分析.