Abstract
胃幽門桿菌是一種螺旋狀的革蘭氏陰性微好氧菌。它被認定為重要的人類胃部致病菌，世界上有超過百分之五十的人口曾被此菌感染。胃幽門桿菌感染可能造成慢性胃、十二指腸發炎或潰瘍的情形，甚至造成胃腺癌以及胃黏膜組織淋巴瘤。複合性的抗生素治療可以達到治癒胃幽門桿菌感染的目的，但是先前研究指出具有抗藥性的胃幽門桿菌菌株大幅增加，因此對於此惡名昭彰的致病菌，開發新的抗生素極為重要。 輔酶A生化合成路徑中的酵素具有成為新的抗生素藥物之標的的潛力，輔酶A藉由維生素B5經過五個酵素反應步驟所合成，為細胞內重要的乙醯基攜帶者，參與許多生化代謝反應。前人研究指出phosphopantetheine adenylyltransferase (PPAT) 所催化的反應是輔酶A合成路徑中的重要調節步驟，而藉由比對發現在哺乳動物及細菌的同源蛋白間沒有具高相似性的序列，因此PPAT是一個具有開發潛力的抗生素藥物標的。 在前人研究中認為胃幽門桿菌的開放閱讀框(ORF) hp1475編碼著與脂多醣(lipopolysaccharide)合成相關之酵素，然而HP1475蛋白保守性序列指出此基因可能編碼PPAT酵素。在本篇研究中為了更進一步指出目標蛋白的特性，我們選殖了hp1475基因並使其在大腸桿菌中大量表現其產物，而表現所得到的重組單體蛋白HP1475分子量藉由MALDI-TOF測量結果為19.7 kDa，其天然狀態的分子量則藉由膠體過濾層析測定結果為88.39 ± 2.44 kDa，在分析型超高速離心實驗中其分子量為79.86 ± 3.37 kDa，代表HP1475可能以四聚體的形態存在於自然界。本研究藉由核磁共振測定反向酵素活性、並且利用酵素動力學測定Km及Kcat值，確定純化後之重組蛋白具有將dephospho-CoA (dPCoA) 和焦磷酸轉換成4’-posphopantetheine和三磷酸腺苷的能力。藉由圓二色光譜分析HP1475蛋白之二級結構含有63.01 ± 10.04 % α螺旋和3.87 ± 2.40% β摺疊的構造。 將HP1475蛋白序列中具有高度保留性的胺基酸殘基進行點突變，研究結果發現Y7和R88對蛋白的水溶性非常重要。在非還原性不連續蛋白凝膠電泳分析結果中顯示，R88與次單位的組裝相關。藉由pymol軟體預測得知這些具有高度保留性的胺基酸殘基可能位於蛋白質的活性位置並與受質結合能力相關。利用電泳及圓二色光譜分析可得知H18與蛋白的穩定性及二級結構有關。測定反向酵素活性及圓二色光譜分析發現，具有高度保留性的胺基酸殘基對於酵素活性極為重要，進行點突變後會致使蛋白喪失其反向PPAT的活性，而造成活性消失的情形並非因為蛋白質二級結構改變。 我們利用反義股RNA干擾技術研究在活體內HP1475的功能，在大腸桿菌表現系統中反義股RNA干擾造成50%至60%的蛋白抑制效果，而在胃幽門螺旋桿菌中造成 60%的蛋白抑制效果。而此HP1475表現受到抑制的菌株具有減慢生長速率以及細胞內輔酶A堆積的生理現象。