Abstract
HIV IN 為逆轉錄病毒早期生活史中重要之蛋白質, 它負責了將病毒的核 酸序列插入寄主的染色體中, 形成潛伏病毒;文獻指出 HIV IN 在許多 in vitro 的實驗中, 已被証實可以單獨執行核酸序列銜接的工作。 而 本篇實驗中所欲探討的是 : IN 若可以在 in vivo 狀態下,單獨存在、 且執行功能, 其首先必須進入細胞核中 。 就多數的核蛋言 : 已有許多 報告分別以採取了刪除/定位突變/ 遺傳工程及化學合成融合蛋白等策略 來模擬核傳送訊號序列(NLS)的活性, 指出核蛋白本含有的NLS 可使細胞 座落於核中;諸如此例可見於 SV40 large T antigen､p53､Polyoma Virus VP1等.. 這種具有NLS的活性序列經分析的結果得知: 大多數由數 個鹼性胺基酸所組成的短鏈, 同時我們在 IN 這個蛋白序列中發現疑似這 種NLS 活性的序列於是我們希望進一步藉由突變的方式來鑑別它的存在。 首先我們建構了一個以Bovine Papilloma Virus Vector 為表現的載體系 統, 將 HIV-I IN 載入上述質體中,此表現系統屬於 Episomal mammalian expression system,由來自金屬硫蛋白(MT)基因之啟動子 (promoter)、Moloney murine Sarcoma Virus 之末端重覆序列 (LTR) 為 促進子 (enhancer) 、 以及 SV40 之 mRNA splicing junction 和 polyadenylation signal 來幫助插入基因有效表現於真核細胞中。同時 此載體也帶有複製所必須之 ori 及來自 pBR322 之 β lactamase之基 因, 使其成為一穿梭載體 。 由於所插入基因與質體大小相距太大(0.8 kb:12.5kb)致使直接的載入的工作不易進行;故先行將病毒基因(BPV)的部 分去除,建構一個只在大腸桿菌中表現的小載體 (4.5kb),將IN基因載入, 成為4571IN, 再將此成功導入之載體接回原來刪除之病毒基因。 此外,也 同樣的針對IN上疑似NLS的序列( 261-267 amino acids),做定位突變, 預期在將來送入細胞(3T3/C127)後,以免疫沉澱的方式,追蹤其表現所座落 的區位是否受到改變,來做為鑑別NLS的根據。