Abstract
The Agrobacterium radiobacter CCRC 14924 N-carbamyl D-amino acid amidohydrolase (Nca), the enzyme used for production of D-amino acids, was overexpressed in Escherichia coli JM109. The crystal of Nca belongs to monoclinic space group P2(1), with unit-cell parameters of a = 70.23 A， b = 67.53 A， c = 137.48 A and b = 96.12°. The phases for Nca were calculated by use of gold and xenon derivatives. The crystal structure was refined to 1.95A, to an R-factor of 18.6﹪with the method of multiple isomorphous replacement with anomalous dispersion. The Nca overall structure is a homotetramer and each monomer shows a four-layer α/βfold with a two six-stranded β sheets packed on either side by two α helices. Xenon atom can bind in a small hydrophobic cavity formed by the intersubunit A-B contracts. Among published structure, Caenorhabditis elegans nitrilase shows structural similarity with Nca with a rms deviation of 1.46 A for Cα atoms and has a similar active site arrangement (Cys-Glu-Lys). The other amidohydrolytic enzyme,N-carbamylsarcosine amidohydrolase (CSHase), despite with distinct structure, also processes Cys-Glu-Lys active site, suggesting convergent evolution of an efficient catalytic framework. Together with other site-directed mutagenesis and biochemical studies, Cys172 is proposed for Nca catalysis.中文摘要 2誌謝. 3第一章 簡介 9（一）D型胺基酸與其在抗生素領域的應用 9（二）D-p-HPG的製程發展 9（三）D-p-HPG二段式酵素法製程的改良 10（四）D-p-HPG單一製程的發展 11（五）Nca生化上的基本特性 12第二章 材料與方法 15（一）Nca的表現及純化 15（二）蛋白質濃縮 16（三）養晶實驗 16（四）散射數據收集及處理 17急速冷卻系統 17抗凍劑的尋找 18散射數據收集 18（五）重金屬衍生物的篩選 19（六）Xenon衍生物的製備 20（七）重金屬結合位置計算 20（八）Nca分子模型的建立 20（九）分子模型的確認 21第三章 結果 22（一）晶體培養 22（二）低溫收集晶體繞射數據 23（三）繞射數據的分析及晶胞單位的判定 25（四）相位取得 26重金屬溶液浸泡測試 26Xe衍生物 27MIRAS相位運算 28（五）晶體結構模型的建立 29（六）Nca晶體結構模型 29（七）Nca單體間的交互作用 31（八）Xe的結合特性 31（九）酵素活化區域的結構 32第四章 討論 34第五章 參考資料 37圖一：D-ρ-Hydroxyphenylglycine及其相關抗生素的分子結構。 43圖二：化學酵素法的反應步驟。 44圖三：化學酵素法生產D-ρ-Hydroxyphenylglycine的反應流程。 45圖四：二段式酵素法的反應流程。 46圖五：Nca晶體（1.15 M LiSO4 ，100 mM HEPES pH = 7.0，23.5℃）47圖六：具有沉澱物附著的Nca晶體。 48圖七：雙晶（twin crystal）的X光繞射點圖。 49圖八：多晶（polycrystal）在偏光顯微鏡下的觀察情形。 50圖九：室溫收集的晶體繞射點圖及其具有的水圈。 51圖十：使用1.15 M LiSO4 ，100 mM HEPES pH = 7.0，15﹪PEG 400，5﹪Glycerol為抗凍劑低溫收集的晶體繞射點圖及其具有的冰圈。 52圖十一：經220 psi, 5min Xe處理的晶體（Xe1）數據，與原始晶體（native crystal）數據繪出的Patterson map（切面：Y ＝ 0.5）。53圖十二：經220psi, 15min Xe處理的晶體（Xe2）數據，與原始晶體（native crystal）數據繪出的Patterson map（切面：Y ＝ 0.5）。54圖十三：計算SSRL收集的兩組數據（原始晶體數據與Xe衍生物（220psi, 8min））後所求得的Patterson map（切面：Y ＝ 0.5）。 55圖十四：PROCHECK計算出的Ramachandran plot。 56圖十五：Nca四單體結構示意圖。 57圖十六：Nca 單體結構示意圖。 58圖十七：Nca二級結構示意圖。 59圖十八：Xenon原子在Nca結構內的結合位置。 60圖十九：三種菌種Nca的胺基酸序列比對：1：Agrobacterium radiobacter; 2：Pseudomonas sp. ; 3：Methanobacter sp. （黑色區域：高度相似，灰色區域：部分相似）。 61圖二十：Nca反應活化區域殘基位置及周圍水分子。 62圖二十一（a）Nca與受質結合的模擬示意圖。 63圖二十一（b）CSHase活化區域。 63圖二十二：Nca催化機制流程圖。 64圖二十三：Nitrilase的反應機制（ESH：Nitrilase參與反應的sulfhy group，【I】：tetrahedral intermediate）。 65圖二十四：NitFhit Rosetta Stone Protein晶體結構（其中Nitrilase在中間區域形成四單體構形）。 66圖二十五（a）：Nitrilase的單體結構。 67圖二十五（b）：Nitrilase活化區域各殘基間的距離。 67圖二十六：Nitrilase和Nca三度空間結構上的疊合（橘色：Nitrilase；紫色：Nca）。 68表一：結晶條件篩選圖（一）。 69表一：結晶條件篩選圖（二）。 70表二：以放置較久的蛋白質溶液（四至五個月）培養出之原始晶體的散射數據。 71表三：以漸進式浸泡法將晶體逐次浸泡於5﹪PEG 400、10﹪PEG 400、15﹪PEG 400的抗凍劑溶液內後所收集的原始晶體數據。 72表四：以immersion oil為抗凍劑所收集的原始晶體數據。 73表五：Au、Hg、U、Ru等重金屬衍生物的製備及其繞射數據。 74表六：Au、Hg、U、Ru等重金屬衍生物在Nca晶體中的結合位置。 75表七：各組重金屬衍生物間的差異值表。 76表八：各組晶體繞射數據及MIR相位數值。 77表九：Nca晶體結構精算數據。 78附錄九 homophenylpyruvate的有機合成（1）。 79附錄九 homophenylpyruvate的有機合成（2）。 80附錄九 homophenylpyruvate的有機合成（3）。 81