Abstract
E6是一個分子量約18kDa的蛋白，且它的基因序列幾乎都被研究出來。由於目前在世界上並無適當的E6抗體可被應用於細胞實驗中，所以引發了本實驗室想嘗試做E6的抗體。首先將493 bp的E6 DNA質體轉接至pE32a以及pQE30載體中，分別製備為pET32a-E6及pQE30-E6質體。接下來再將這兩種質體分別轉形 (transformation)至BL21及SG13009菌株中，之後利用IPTG去表現E6蛋白，轉形pET32a-E6質體的菌株表現的為His-tagged E6-thioredoxin融合蛋白 (簡稱Trx-E6蛋白)，而轉形pQE30-E6質體的菌株表現的為His-tagged E6融合蛋白 (簡稱6X-His-E6蛋白)。將純化出的這兩種蛋白當做抗原(antigen)並選用老鼠及兔子兩種系統來進行免疫以分別製備單株和多株抗體。實驗結果得到了H20和H50兩株融合瘤細胞，接著製備腹水並純化抗體。實驗結果發現所製備出的單株抗體稀釋1000倍後及兔子anti-E6血清稀釋500倍後，分別可利用西方點墨法偵測到50 ng及0.5 ng的6X-His-E6蛋白。另外，也發現由6X-His-E6抗原產生的兔子anti-E6血清其霊敏性比Trx-E6抗原產生的兔子anti-E6血清和單株抗體來的高。由於實驗中製備的E6抗體可成功地可辨認到0.2 mg 轉殖E6基因的TK6細胞 (T15)中E6蛋白表現及0.15 mg SiHa細胞E6蛋白表現。因此實驗室所製備出的抗體可辨認到細胞中E6蛋白表現，將可應用於後續亞砷酸鈉對子宮頸癌細胞E6影響之探討。 砷化合物是常見的天然產生物，目前已知它是一種致癌基因，伴隨著肺癌、膽囊癌、表皮癌、腎癌、肝癌及前列腺癌。近年來三氧化二砷arsenic trioxide (As2O3)已被廣泛應用於治療急性前骨髓淋巴瘤(APL)，且最近的研究中亦有趣地指出砷具抗癌的特性。子宮頸癌高居婦女癌症死亡原因的第二位，超過百分之九十的子宮頸癌細胞被不同型的人類乳突病毒(HPV)感染，而這些細胞大多擁有正常的p53抑癌基因，但在這些子宮頸癌細胞裡，人類乳突病毒E6基因會透過ubiquitin的途徑抑制p53功能。在之前研究中指出，當表現E6的子宮頸癌細胞SiHa處理亞砷酸鈉(SA)後，可恢復SiHa細胞內p53表現，根據這些理論來探討亞砷酸鈉是否能藉降低E6表現進而回收復53表現達到增加X-ray對子宮頸癌的細胞毒性。SRB實驗結果發現當合併使用亞砷酸鈉及X-ray會加成降低細胞存活率。但SA增加X-ray所造成的細胞毒性機制尚不清楚，我推測p53和E6在其中扮演著重要的角色，首先單獨處理X-ray時只會略微增加p53表現，當單獨處理亞砷酸鈉或合併使用亞砷酸鈉及X-ray能明顯增加p53表現；另外，亦發現合併處理亞砷酸鈉和X-ray或單獨處理亞砷酸鈉後其E6 mRNA的表現量明顯降低，單獨處理X-ray只會略微降低。由於SiHa細胞E6蛋白表現量低，所以使用免疫沈澱法偵測E6蛋白表現，其結果和RT-PCR相似。在同樣的設計模式下也偵測和細胞凋亡有關的基因pro-caspase 3蛋白表現，且發現合併使用亞砷酸鈉和X-ray後，pro-caspase 3蛋白表現明顯地比單獨處理亞砷酸鈉或X-ray低。由以上結果顯示亞砷酸鈉能加成性的增加子宮頸癌細胞對放射線的敏感性，且或許可應用於臨床上，合併使用亞砷酸鈉及X-ray來更有效地治療子宮頸癌。為了更進一步証明亞砷酸鈉增加X-ray對子宮頸癌的細胞毒性的確是透過調控E6表現，所以實驗中使用了轉殖E6的TK6細胞株 (T15)來証明我的理論，在同樣實驗設計下，不論在p53、pro-caspase 3及E6表現亦發現和SiHa細胞相同的結果。因此，亞砷酸鈉增加X-ray對子宮頸癌的細胞毒性的確是透過調控E6表現並回復p53蛋白表現。