Abstract
表現異體蛋白於動物細胞表面有助於某些疾病的治療。被表現的蛋白有幾個區域 (domain) 被認為與細胞表現此蛋白在表面上的效率有關，包括: (1)膜外區域 (extracellular domain) (2) 間隔區域 (spacer) (3) 穿膜區域 (transmembrane domain) (4) 細胞質區域 (cytoplasmic domain)。前人的研究指出，利用人類膽醣蛋白 (human biliary glycoprotein) 的N端做為間隔區域來表現抗CD3單鏈抗體時，可提高此重組抗體在細胞膜上的表現量，若當此間隔區域上的N-醣基化位 (N-linked glycosylation sites) 被突變後則會降低其表現量。本論文的實驗目的有二: (1) 尋找可增加膜上蛋白表現的基因突變位; (2)利用構築完整的細胞質尾端片段 (cytoplasmic tail) 之嵌合蛋白 (chimeric protein) 來探討此對蛋白在膜上表現的影響。為了探究可增加蛋白在膜上表現效率的基因突變位，本實驗構築了一包含N-醣基化位突變的膽醣蛋白N端作為蛋白間隔區域、囓齒類B7分子之穿膜部位及細胞內區域蛋白片段之嵌合蛋白進行定向分子演化 (directed molecular evolution)。定向分子演化是蛋白質改造工程中的重要工具。實驗設計將包含此三部份的嵌合蛋白cDNA先以error-prone PCR進行不同程度的隨機突變，將總突變率為0.30%及0.47%的突變基因庫分別以反轉錄病毒感染的方式送進標的細胞，利用流式細胞儀來偵測細胞膜上嵌合蛋白的表現，表現量高的細胞族群以此方式篩選出來，增殖其突變基因作為DNA shuffling的材料進行突變重組；重組後的突變基因庫同樣以反轉錄病毒感染的方式送進標的細胞內再進行三次篩選(sorting)。經篩選過細胞株族群之基因定序結果發現某些個別基因突變會增加嵌合蛋白在膜上的表現。並發現嵌合蛋白間隔區域有六個突變位，且此六個突變位將原本構築突變之N-醣基化位回復為原始的N-醣基化位；此結果顯示本實驗所使用的分子演化法及篩選方式可達到與自然選汰類似的結果。