Abstract
氣喘之平均發生率逐漸上升,且死亡率有漸增之趨勢,因此其重要性日益突出.氣喘之嚴重度被認為與呼吸道內嗜酸性白血球引起之發炎有正相關.在死於氣喘之病患病理解剖上發現大小之肺內呼吸道充滿阻塞性黏塊,其中有極多脫落上皮與嗜酸性白血球.有實驗證實嗜酸性白血球與氣管上皮之脫落有很大的關係.因此嗜酸性白血球被認為是與氣喘最直接的主要作用細胞. 嗜酸性白血球可分泌四種毒性蛋白,其中eosinophil cationicprotein (ECP)被發現大量存在於氣喘病患之氣管壁上與氣管沖洗液中.ECP在動物實驗中也會對呼吸上皮造成傷害.ECP可反應慢性氣喘者其氣管阻塞之嚴重度,即ECP較高者,其肺功能就較差.若給予抗氣喘藥物,如類固醇(steroid),則一開始有較高ECP之患者會很快降低其ECP值.因此ECP可被用來監控氣喘藥物的治療成效. ECP本身是個單鏈之polypeptide,由160個amino acid 構成,分子量18440,且ECP可產生穿越細胞膜的管道(transmembrane channel),如打洞素(perforin)般具有在細胞膜上穿孔之作用.既然ECP可傷害氣管上皮細胞膜,又可代表氣喘之發炎狀態;類固醇可使ECP下降,又是治療氣喘之慢性發炎階段之良藥.顯示ECP在氣喘之病理變化與藥物治療佔有一關鍵性角色.因此本研究目的在於<1>探討ECP之細胞毒性作用之分子機轉<2>比較ECP對不同組成之細胞膜傷害程度之差異.本實驗利用電腦模擬來預測ECP之三度空間結構.並與打洞素及核糖核酸酵素比較胺基酸序列,以找出可能穿越細胞膜之所在片段.同時以蛋白質合成儀去製造此一胺基酸片段,且測試其是否具有ECP破壞細胞膜之毒理作用.我們也可以不同組成之phosphatidylcholine去形成不同之微脂粒.磷脂之雙鍵之有無,可影響微脂粒之流離性(Fluidity).本實驗利用雷射測徑儀來監測微脂粒之直徑之變化,並以氫質子及磷31之核磁共振光譜來探索ECP加入不同微脂粒後之細胞膜訊號消失情形.此外,也將類固醇加入微脂粒中以探知是否會影響ECP之細胞毒性作用.最後以質譜儀來測定被ECP作用後的磷脂碎片,以求證ECP的作用機轉. 實驗結果顯示,ECP中第28至第58胺基酸序列片段,擁有穿越細胞膜的alpha螺旋-beta轉-alpha螺旋三度空間結構.但此30個胺基酸合成之胺基酸片段缺乏使細胞膜破損之能力.由氫質子及磷31之核磁共振光譜,發現不同組成之微脂粒對ECP有不同之感受度.且帶有較多雙鍵組成之微脂粒,反而較不易被ECP之類毒性蛋白所穿破毀損.此外,分析質譜儀之結果發現,質量數184之細胞膜碎片,在加入ECP後之微脂粒中有將近2倍之增加量.ECP切斷phosphatidylcholine第3鏈之CH2-OP之鍵結,可以產生此質量數184之片段,其分子機轉與核糖核酸酵素之作用機制相似.ECP之作用點在其胺基酸序列上的第36位置-麩胺,第65位置-離胺基酸及第115位置-組織胺酸.最後我們發現類固醇有保護細胞膜,以免受ECP毒性蛋白傷害之作用.整個保護過程,完全不需任何細胞膜訊號傳遞之機制 .