Abstract
本研究的主要目的在探討本土水產養殖病原菌 Flavobacterium ranacida之內毒素(脂多醣，lipopolyscaride；LPS) 對血小板凝血機制的影響。目前已由菌體分離得到脂多醣，再經由酸水解和管柱色層分析法分離純化脂多醣毒性所在的脂質 A (Lipid A)。以脂質 A 和血小板作用之後，觀察血小板對各種生理刺激所產生的凝集反應和生化現象，來探討脂質 A對血小板凝血機制的影響。以磷脂球型式存在於HEPES-Tyrode's緩衝溶液中的脂質 A，其直徑自 5 至 400 nm 不等。以膠濾型血小板進行脂質 A的 uptake 實驗時發現，不同濃度的脂質 A liposomes 皆有40% 被血小板 uptake。在富含血小板的血漿 (PRP)中，脂質 A 的作用會使collagen 造 成的血小板延滯時間和形變時間增加，同時抑制凝集初速度和凝集百分比；同時脂質 A 會顯著抑制 U46619 和 ADP 對血小板的初級可逆性凝集和第二階段的不可逆反應。在膠濾型血小板中，脂質 A 會抑制 collagen 在血小板上造成的形變、凝集初速和凝集百分比。對低濃度 thrombin (0.01U/ml) 產生的作用則會有 dose-dependent 的促進現象。和脂質 A liposomes 融合後的血小板外觀會從鐵餅狀 (discoidshape) 變為多縐褶圓盤狀 (lumpy disk)，同時對低濃度 thrombin 和高濃度 collagen 造成的血小板形態變化亦有影響。此外，直接加入脂質 A的血小板內自由鈣離子濃度會以脂質 A dose-dependent的模式緩慢增加，同時會造成低濃度 thrombin 刺激血小板內自由鈣離子濃度以加成(additive) 的趨勢增加；對高濃度 collagen 所造成的細胞內鈣離子濃度變化則出現了明顯的抑制。在 serine/threonine kinases 的實驗中，脂質 A 會少量促進 20 kDa的磷酸化，明顯促進 47 kDa 的磷酸化；並以加成的趨勢促進低濃度 thrombin 造成的20 kDa 和 47 kDa 磷酸化；在抑制 collagen 的作用上，脂質 A 會使 20 kDa 的磷酸化程度下降，47kDa的磷酸化程度則維持不變。在加入脂質 A 溫浴的血小板中，有一分子量為 51 kDa 的蛋白質會產生顯著的tyrosine phosphorylation。在促進低濃度 thrombin 和高濃度 collagen 的作用中則表現出不同的模式﹕低濃度 thrombin 所造成的 125、116、97 和 89 kDa 因為脂質 A的存在而磷酸化程度增加，其餘蛋白質則無明顯差異；另外脂質 A 會對 collagen造成的大部分蛋白質 tyrosine phosphorylation 產生明顯抑制，僅有64、60 和 51 kDa 不受影響。在深入了解脂質 A 對 collagen 在三分鐘內的抑制作用實驗中，則可明顯看出脂質首先影響 71-78 kDa 的 Syktyrosine kinase 的活性，再依序對大部分的蛋白質tyrosinephosphorylation 發生抑制作用。以目前的研究結果推論﹕脂質 A 和血小板作用後，增加了 51 kDa (已知為一 tyrosinephosphatase)的活性，破壞了血小板內 PTK/PTP 作用的平衡，進而影響到血小板的正常生理功能。