Abstract
DNA雙股斷裂是當細胞遭到游離輻射照射時產生最嚴重的傷害.為了瞭解細胞輻射敏感的機制,有一些游離輻射敏感的突變株,已從中國倉鼠卵巢野生型K1細胞被篩選出來 .其中xrs5和xrs6已知缺失將DNA雙股斷裂重新連結的能力,同時也對MMS, EMS,UV等DNA傷害劑敏感;除此之外在這些突變株中有十一種基因的表現較差.從最近的研究推論xrs突變株缺乏 Ku蛋白質的80kDa次單元及Ku蛋白質所具有與DNA端點結合的特性,在xrs突變株中表現人類Ku80則可使此轉染細胞株之DEB活性與對游離輻射的抗性同時回復.為了解DNA雙股斷裂的修復系統,本實驗室已由xrs6細胞株中篩選得到表型自然回復株SR16,由先前的研究發現SR16對X-ray和UV具有抗性,然而卻對MMS和EMS依然敏感;同時SR16細胞也具有DEB活性.本論文主要在探討 Ku蛋白質是否參與MMS,EMS和UV所造成DNA傷害的修復路徑.人類Ku80互補DNA是利用反轉錄及聚合酵素連鎖反應的方法獲得,此 cDNA接著被選殖於可在真核生物系統表現選殖DNA的表現載體pcDNA3中,之後利用lipofection的方法將此表現質體送入xrs6細胞中.利用G418篩選穩定的轉染細胞,並將之培養成細胞株;將十二個獨立細胞株混合而成的混合細胞株對IR具較高之抗性.以獨立細胞株中的x6hk803與混合細胞株進行之後的實驗顯示:雖然利用北方墨點轉漬實驗在轉染細胞株中,無法檢測到 Ku80 mRNA的訊號,但可藉由反轉錄及聚合酵素連鎖反應,偵測到轉染細胞株中有人類Ku80 mRNA表現的情形.雖然利用西方墨點轉漬實驗在轉染細胞株中,無法檢測到Ku80蛋白質的訊號,但可利用電泳泳動偏移測定偵測到 Ku80轉染細胞株中具Ku蛋白質特有的DEB活性,故確知在x6hk803及mix transfectant中有Ku之表現而且具生物活性.由細胞存活實驗中得知Ku80轉染細胞株對MMS和EMS具抗性,但對UV敏感.本實驗也對Ku是否調控某些基因的表現加以探討.結果顯示在xrs突變株中mRNA表現量較低的基因-B52與B29在Ku80轉染細胞中表現仍然不佳;故 Ku蛋白質並不參與調控這些基因的表現.從本論文結果推論Ku蛋白質參與X-ray,MMS,和EMS所造成DNA傷害的修復路徑;同時,參與另一機制的分子具有與DNA free ends結合的能力,因為 SR16細胞對IR及UV具抗性並具有DEB活性,但對 MMS和EMS依然敏感.