Abstract
壹、 多種同型金屬硫蛋白在豬肝中的表現中文摘要同源基因是彼此之間高度相似的基因，而且由於過於類似而經常難以分辨，例如：金屬硫蛋白。金屬硫蛋白是富含半胱氨酸的金屬結合蛋白，在不同的生物中，由一種或多種同源基因所控制。獲得不同金屬硫蛋白的傳統方法是仰賴離子交換管柱層析法分離純化，或是將其基因從基因庫中篩選個別基因，分別送入重組基因表現系統表現而得之。肝臟是動物體內大量誘發性基因表現的器官，本論文中，結合RT-PCR及部份蛋白質定序分析法，鑑定豬肝中金屬硫蛋白的表現受制於一組或多組的同源基因。結果顯示，藉由此方法可推定所表現的金屬硫蛋白同源基因有十種之多。利用演化樹分析，其中七種是屬於目前已知的四類金屬硫蛋白中的第一類MT-1，兩種則與第二類MT-2相近，另外一種可能為偽基因(psuedogene)，但無發現第三類及(MT-3)第四類(MT-4)。這些金屬硫蛋白同源基因在此命名為pMT-1a至-1g，以及pMT-2a和pMT-2b。它們皆有其獨自的DNA序列。pMT-1e1和pMT-1e2的 DNA序列雖然不同但卻載有相同序列的氨基酸密碼。pMT-1b和pMT-1g的cDNA 序列不同，其中半胱氨酸(cysteine)的密碼被精氨酸(arginine)的密碼所取代。半胱氨酸在金屬硫蛋白中的保守性極高，所有的動物金屬硫蛋白均是20個半胱氨酸，缺少一個半胱氨酸的這種情形是首次被發現的。MT-2在位置10或11通常都載有酸性氨基酸，pMT-2a和pMT-2b卻有異於此，但根據演化樹分析仍應歸類於MT-2。另外，氨基酸序列比較結果顯示，人與豬的MT-1相關性很遠，可能暗示人與豬的MT-1同源基因是在人與豬演化分歧之前即各自獨立演化。由於有十種不同的金屬硫蛋白同源基因在肝臟中大量表現，本論文指出金屬硫蛋白是由superfamily的基因所轉譯，而且可能具有組織和功能的專一性，控制每一種基因表現的時間，在發生發育上應具有重要意義。貳、酵母菌RNA結合蛋白質RBP1之研究中文摘要RBP1是帶有兩個RNA結合區(RRM)的RNA結合蛋白質。本論文顯示RBP1基因缺陷(knockout)的酵母菌PSY581生長速率較野生型快，將RBP1蛋白質過量表現於RBP1基因缺陷(knockout)的酵母菌時，可使酵母菌生長速率明顯減緩，相較之下，僅有表現載體之酵母菌的生長速率卻無顯著影響，顯示RBP1蛋白質對細胞生長的影響是專一性的，而且可抑制酵母菌的生長；此外，將NH2及COOH端除去一部分，僅含RRM1和RRM2區域的蛋白質過量表現時，其生長速率並無顯著影響，換言之，RBP1蛋白質的NH2-及COOH-端對其抑制細胞生長的活性是必需的。另外，為了探討RBP1抑制細胞生長的分子機制以及其可能的生物功能，以差異性顯示法(differential display) 比較野生型與RBP1基因缺陷的酵母菌中基因表現的情形，發現至少有兩種基因的表現有差異。其一為與訊號傳遞及能量代謝有關的adenylate kinasegene (ADK1)，在RBP1基因缺陷之酵母菌中其mRNA表現減少。此外，有一基因在RBP1基因缺陷之酵母菌中mRNA表現增加，由Northern blot分析得知其mRNA約為0.75 kb，可能為核醣體蛋白RPL13。由cDNA推測的氨基酸序列經比對後，與人類breast basic conserved gene 1 (BBC1) 有48.1%相同，而BBC1是普遍存在於各種生物的，在快速生長的腫瘤和胚胎細胞中表現量較高。以上結果顯示: RBP1蛋白質的確可透過影響相關基因的表現而調節細胞的生長速率。