Abstract
目前已知Ku自體抗原乃由Ku70及Ku80兩個次單體所組成,且具有結合雙股DNA端點的能力.同時,Ku蛋白質亦為去氧核糖核酸依存性磷酸化酵素的構成要素之一.同樣地,亦為DNA-PK構成要素之一的一350kDa的次單位, DNA-PKcs(p350),具有在體外將許多核蛋白質,例如,Sp-1,Oct-1,p53, RNApolymerase II等磷酸化的功能.並且由最近的研究結果顯示,Ku蛋白質可能參與在修復斷裂的雙股DNA的機制中.而為進一步了解Ku蛋白質所參與的DNA修復機制,我們需要大量純化的 Ku80及Ku70蛋白質.於是,我們利用反轉錄酵素及聚合酵素連鎖反應的方法,以所設計的引子與HeLa的核糖核酸進行RT-PCR後,得到人類Ku80密碼股DNA.之後,再將人類Ku80密碼股DNA選殖到細菌表現質體,pQE30.此質體具有一乳糖誘導啟動子,並可表現出一在N端具有連續六個組氨酸的融合蛋白;我們發現以0.5mM的IPTG處理三小時可得最大產量之人類Ku80蛋白質.此時之細菌用超音波打破,並用含有8M尿素的Buffer B將hKu80蛋白質由內含體溶出.將離心所得的上清液通過Ni-NTA管柱,而由於融合蛋白上的六個組氨酸在酸鹼值8.0時可與Ni-NTA上的鎳原子進行很強的共價結合,故其它蛋白質可在此時被沖洗掉,與鎳結合的Ku80蛋白質,則用酸鹼值為4.5之 Buffer E沖堤.目前我們正在純化大量的人類Ku80蛋白質,並將利用單株抗體或多株抗體與純化的蛋白質進行西方墨漬法確認,或與同樣在細菌系統中所表現出來之hKu70蛋白質,進行DEB活性分析.