Abstract
利用免疫篩選法, 從肝細胞HepG2 的互補基因庫中篩選了二百萬個溶菌體, 共選出六個可能是人類第一型拓樸異構酵素的互補DNA, 分別是A1, B1, C1, D1, E1及F1, 經過核酸定序, 基因表現以及與酵母菌拓樸異構酵素I 的胺基酸序列比較結果, D1(704鹼基對) 的胺基酸組面和酵母菌的第一型拓樸異構酵素有42％的相似性。若將D1接於基因表現載體(T7系統)后, 則可以在大腸杆菌(E.coli BL21(DE3))中表現, 以聚兩醯膠電泳分析確定下Dl表現出 32k的多勝鍵, 這個多勝鍵可以被抗人類第一型拓樸異構酵素的抗體所確認。此D1 cDNA 用 P-dCTP標志, 再做為放射性探針, 可以確認HeLa細胞中所萃取出的4.0Kb mRNA, 經過這一連串的實驗證明, 我們肯定的得到人類第一型拓樸異構酵素的部份片斷cDNA。為了更進一步得到更大更長的第一型拓樸異構酵素cDNA, 我們利用Dl做放射性探針,由HeLa細胞cDNA庫及肝細胞HepG2 cDNA庫中再做進一的篩選, 在二百萬個溶菌斑噬菌體中, 得到1.3kb, 1.8 kb, 及2.7 kb的cDNA選殖體。得到的cDNA選殖體分別分主、純化, 再以Sanger的方法做核酸定序, 胺基酸組成序列的比較以及基因表現, 得知1.3 kb及2.7 kb cDNA 為人類第一型拓樸異構以酵素的基因, 分別命名為htopol-D3, htopoI-D2, 而1.8 kb cDNA 只有3 ’端部份是第一型拓樸祑構酵素的基因部份, 5 ’端則否, 這種現象出現在多種cDNA上, 可能是基因發生重新組合所引起的。經由DNA 限制酵素作圖(mapping) 及核酸定序的分析, 知悉D3包括了整段D1, 而D3的3 ’端和D2的5 ’端有590 bp的重疊區域, 在這區域內, 兩段DNA 有一共同的Sst Ⅱ限制酵素作用部位。因此D3與D2以Sst Ⅱ作用後再以T4 DNA ligase 接合, 得到一全長3.3 kb的cDNA, 稱為htopol-D4。在同一時期, D’Arpa P.等人發表了3654 bp 的人類第一型拓樸異構酵素的基因序列, 並利用Nothern blot方法確定此異構酵素的mRNA為4.0 kb, 顯然, 我們得到的cDNA均非全長。我們進一步和美國癌症研究所(NCI) 彭汪嘉康博士合作, 以 P-及 H-。標志的D1和D2做探針, 以人類細胞–鼠細胞雜合法及定位(in situ) 雜合法, 定出人類第一型拓樸異構酵素的基因系位於第20對染色體的長臂p12-13.2位置, 這結果發表在美國期刊Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85, 8910-8913, 1988。我們進一步想探討此種異構酵素的構造與功能間的相互關係, 研究其功能區域。我們將第一型拓樸異構酵素的cDNA接入T7表現載體中, 得到的質體定名為pJ, 可以在細菌BL21(DE3) 培養液中由IPTG的誘導而表現出。用Exo Ⅲ╱Mung-bean 核酸酵素將pJ質體由5 ’端做一連串系列縮減, 裁減的質體經T4 DNA ligase 接合后, 送入細菌HB101 轉形(transformation), 得到的一系列DNA 均經分離, 純化, DNA 定序, 決定何者是正確的open reading frame, 可以在細菌BL21(DE3) 中加以表現。