Abstract
糖尿病( Diabetes mellitus ) 是一個複合性疾病其主要的臨床症狀是不正常高的空腹血糖值。此疾病影響全人類5 % 的人口，而且它的罹患率( incidence ) 逐漸增加中。荷爾蒙胰島素( insulin ) 由Banting 及Best 在1922年分離出，調控正常葡萄糖( glucose )的□定 ( homeostasis )，也會參與其他的生理效應 ( physiological effects)。胰島素經由與大部分細胞的細胞膜上接受器 ( receptor ) 交互作用而呈現出生物活性 ( biological activities )。這個會導致在許多生理過程的多基因效應 ( pleiotropic effect )，包括攝取不同的營養物，及增加肝醣 ( glycogen )，脂質，一些胺基酸及蛋白質的合成。除此之外，胰島素還能促進許多培養的動物細胞之增殖 ( proliferation )。這些過程至少有一部分是由細胞內第二傳遞信使( secondary messenger)鈣 (Ca) 或環狀腺核甘單磷酸 ( cyclic AMP ) 所居間促成的。雖然服用胰島素可改善糖尿病的症狀而且能增加幾分的正常生活，糖尿病及其併發症仍然是美國第三大疾病的死亡原因。然而糖尿病的病因學( aetiology )雖然還是不清楚，可能包含環境因素(environmental factor，如攝食、病毒、化學藥物) 及遺傳因素 (genetic factor )。人的胰島素基因( human insulin gene ) 含有兩個插入子序列(in- tervening sequence )，一個在轉錄區之內到傳訊mRNA 的5’端未轉譯部分( 5’-untransiated segment of the mRNA )，另一個中斷C-peptide的表現區。比較人與老鼠的胰島素基因( insulin gene )，顯示在DNA部分基因之前有潛在性調控區 ( potential regulatory region ) 因此認為胰島素基因在演化上具有共同型式的祖先，含有兩個插入子序列(intervening sequence )。乳酸菌 Lactococcus lactis (L. lactis ) 為一株重要的工業用乳酸菌，通常被用來發酵牛乳( milk) 以製成各種乳酪( cheese )(46,47,48)。目前已有利用此菌株 ( L. lactis ) 上的USP 45 分泌訊號胜(secretion peptide)表現及分泌蛋白質的研究被發表出來，如proteinase，α-am ylase，TEM-β-lactamase 等(2,3,33,34,37,38,39,42,54)。本論文研究著重於使用化學合成方法及分子選殖將USP45 分泌訊號胜( secretion signal peptide )及人的胰島素基因(human insulingene ) 連接起來，然後接到含有FRT ( FLP recombination target site )及kanamycin resistance gene 的質體pEAW 127，此兩個基因物質被放置在兩個Tn 5 之間，由於kanamycin resistance gene 將先被切除我們以反向PCR (inverted PCR) 將其切除而且PCR的引子(primer)預放兩個限制位 (restriction sites ; 3’-NcoⅠ，5’-Avr Ⅱ)接著使用這兩個限制酵素分別作為化學合成片段USP45分泌訊號胜加人的胰島素基因及kanamycin resistance gene(53)被切除的片段，然後將此兩個DNA 片段利用T4 DNA ligase 連接起來，以建構plasmid pEUI-1。接著將此plasmid 位於兩個EcoRⅠ位置中間的複製起點(origin of replication;ori )序列用限制酵素EcoRⅠ切除，再以T4 DNA ligase連接起來，然後將此處理過的質體( plasmid )用電擊(或電穿透)(electroporation)(55,56) 送入乳酸菌(Lactobacillus acido-philus)(36,37,50,51,54) 中表現及分泌人的胰島素蛋白(human ins-ulin protein)。