Abstract
中樞神經系統的神經後突觸緻密體(postsynaptic density,PSD)是一位在 神經後突觸膜下方, 電顯深染的緊密蛋白質結構。生化分析結果指出,PSD 可能直接或間接參與神經衝動傳導的調節。神經接合區 (synaptic junction, SJ)蛋白質, 其包括90％以上的PSD, 被用來當作研究PSD的啟 始材料。利用SDS-PAGE初步分離SJ蛋白質, 切取90KDa位置的蛋白質膠 體, 經注射兔子後得到一多株抗體,Anti-90K Ab。再利用Anti-90K Ab篩 選豬腦cDNA library, 而獲得一1.6Kb的CW1 cDNA。為了進一步證實CW1 cDNA是否帶有encoding 90KDa SJ 蛋白質的遺傳訊息, 因此CW1 cDNA被選 殖到pGEX-2KS表現載體中並且送到E.coli中大量表現glutathione-S- transferase(GST)╱CW1 相融合的融合蛋白質(fusion protein), p83GST 。帶有GST的融合蛋白質, p83GST 可經由glutathione Sepharose 4B affinity column純化出來, 並且經由蛋白 thrombin 作用, 可將26KDa GST和57KDa之CW1 cDNA表現蛋白截切分離, 再一次通過glutathione affinity column即可除去26KDa GST 蛋白質而純化出57KDa的CW1 cDNA 表現蛋白。為進一步簡化CW1 cDNA 表現蛋白的純化步驟, 因此改選用 pQE-31表現載體來表現 CW1 cDNA。CW1 cDNA被選殖到pQE-31載體後送到 E.coli中, 可大量表現－ 57KDa 之6XHis╱CW1相融合的蛋白質, p57His 。此帶有6XHis的p57His融合蛋白質可經由Ni-nitrilotriacetic acid( Ni-NTA) resin column純化出來。再利用純化的p57His蛋白質注射兔子 後, 獲得一株可同時辨識p83GST及90KDa SJ蛋白質的兔子抗體血清, 90B anti-serum。在競爭實驗以及免疫吸附分析的實驗中, 顯示p83GST蛋白質 可以競爭掉 90B anti-serum中辨識90KDa SJ蛋白質的recognition sties,因此初步證實CW1 cDNA確實帶有可以encoding 90KDa SJ蛋白質的 遺傳訊息。