Abstract
摘要 在大腸桿菌的代謝途徑中，天冬胺酸激 脢III為控制離胺酸生合成的一個重要酵素，天冬胺酸激脢III為一異位酵素，已知在酵素活性與基因轉錄上受到終端產物離胺酸的回饋抑制：抑制酵素的生合成．並且白胺酸也會對野生種的天冬胺酸基脢III有活性抑制的效果．本論文在比較突變種(胺基酸序列352處的蘇胺酸變為脯胺酸)的天冬胺酸激脢III與野生種的天冬胺酸激脢III在對離胺酸及白胺酸的結合能力上的改變作一探討，並且利用酵素動力學的方式來看基質與野生種和突變種天冬胺酸基脢III的結合機制。 首先將野生種和突變種天冬胺酸激脢III的基因殖入載體pUC19上而形成質體pUC19AKIIIW及pUC19AKIIIM，進而轉形到大腸桿菌DH5a中進行表現．之後將細菌收集以bead beater均質器振碎離心收集上清液，經過鏈黴素硫銨酸3﹪(w/v)將大量的核酸沈澱，再由50﹪硫酸銨沈澱濃縮，經過HW-55膠體過濾層析管柱，DEAE-Sepahcel(Q-Sepharose)離子交換樹脂分離，再經過Mono-Q離子交換樹脂和Superdex 75過濾層析管柱而得到純度達95﹪以上的野生種和突變種天冬胺酸激脢III。 利用這些純化過的天冬胺酸激脢III進行酵素動力學的實驗，將固定量(4微克)的酵素放入反應混合溶液中，在30℃, pH 7.0狀態下反應30分鐘後看產物(apartohydroxamate)在溶液中的濃度．首先探討基質的結合機制，由於天冬胺酸基脢III為具有兩種基質(腺甘三磷酸和天冬胺酸)的酵素，所以固定不同的腺甘三磷酸濃度然後變化天冬胺酸的濃度反應30分鐘後測波長540毫微米的吸光值以求出產物的濃度而求出反應速率．然後用速率倒數和天冬胺酸倒數為座標作圖來看圖形的形式並且利用此圖所求得線性迴歸直線的斜率和y軸截距來和腺甘三磷酸作圖而求得當天冬胺酸激III--腺甘三磷酸--天冬胺酸複合體形成時的解離常數和單位毫克單位分鐘的酵素反應速率值．由此實驗發現野生種和突變種天冬胺酸激脢皆可和酵素形成天冬胺酸激脢--腺甘三磷酸--天冬胺酸的複合體，而突變種的此複合體較野生種為穩定，但突變種的單位毫克單位分鐘的反應速率較野生種為高．此外由野生種對終端產物的回饋抑制作用來看野生種的基質結合順序，利用固定兩種基質之一在飽和濃度而另一基質固定在不同濃度，然後變化離胺酸的濃度來看離胺酸對各個基的抑制行為模式，發現為無競爭性模式(non-competitive)，所以野生種的天冬胺酸激脢III為任意的(random)基質結合模式．由於突變種對離胺酸和白胺酸並無抑制作用發生，所以無法由此看出突變種的基質結合模式。 因為離胺酸和白胺酸對突變種的天冬胺酸激脢並無抑制作用發生，推測離胺酸和白胺酸對突變種的結合能力應該和野生種不同，所以經由平衡透析的方式來看突變種天冬胺酸激脢III對離胺酸和白胺酸的結合能力變化．經由Scatchard圖和Hill圖發現突變種的天冬胺酸激脢III確實對離胺酸和白胺酸的結合能力變弱了， 因此更確定了突變種天冬胺酸激脢III在蘇胺酸變為脯胺酸的變化中對酵素結構上確實有影響。