Abstract
本篇論文主要目的,在探討人類後天免疫缺乏病毒 1 型的核酸銜接酵素( Integrase),它的功能與結構的關係.野生型的核酸銜接酵素,在細胞外,具 有三種功能: 1.內核酸酵素活性(Endonuclease activity)。 2.病毒 c- DNA 插入寄主DNA 的活性 (Strand transfer activity)。 3.病毒DNA 從 寄主DNA 跳出,形成兩個二股 DNA (Disintegration)。我們利用大腸桿 菌(JM109),生產重組融合蛋白質(IN-GST)共有四種,分別為 pIN54, pIN139,pIN200,pIN283, N 端各連接一個 GST蛋白,用不同方法純化:1. 含 pIN54 的細菌萃取物,通親合性管柱(Glutath- ione sepharose 4B) 可得到相當純的 pIN54。 2. pIN139, pIN200, pIN283 先通過陽離子交 換樹酯(CM Sepharose), 再通過分子篩管柱( S-200 column)可得到部份 純化的融合蛋白, 此外我們也純化出野生型的 IN 。 四種純化的部份IN 融合蛋白及野生型 IN,再次用西方點漬法 (Western blotting)檢驗,確 認IN 的存在。由純化來的融合蛋白做活性的分析, 得到以下結論: 1.核 酸銜接酵素之內核酸酵素活性區域位於 1-139 aa 之間。 2.內核酸酵素 活性的表現, 不必以多聚體(Oligomer) 的型式, 即以單體(Monomer) 的 型式, 切病毒 LTR 3'端二個核甘酸。 3.內核酸酵素活性區域比 DNA 銜 接活性(Strand transfer) 的區域要小,兩活性區域重疊, 但並非同一活 性位。 4.在執行病毒雙股 DNA 轉移(Strand transfer) 的活性時,不出 現DNA的轉移, 而繼續分解病毒 DNA 的 LTR, 呈現另一種類似階梯式的 核酸酵素活性, 因而推測接IN 的 GST 蛋白干擾IN 的折疊及功能,使 IN 的構形發生變化, 無法將LTR自 3'端切掉GT 再插入寄主DNA中。