Abstract
眼鏡蛇蛇毒主要由心臟毒素(cardiotoxins, CTXs)、神經毒素(neurotoxins, NTXs)、與磷脂水解酵素A2 (phospholipase A2, PLA2)三類毒蛋白所構成。目前已知神經毒素會與乙醯膽鹼受體結合，而磷脂水解酵素A2會水解磷脂質，只有心臟毒素的作用目標一直還不清楚。我們實驗室的學長姊去年研究發現:在活體外，心臟毒素可以與一些聚胺基葡萄糖(GAGs)結合，因此我們推測細胞表面的聚胺基葡萄糖可能是心臟毒素的作用目標。而從非洲眼鏡蛇(Naja nigricollis nigricollis)蛇毒中分離出來的磷脂水解酵素A2(N-PLA2)也會與聚胺基葡萄糖中的肝素(heparin)結合。由於過去的文獻曾指出，磷脂水解酵素A2的生理毒性與其酵素活性並無相關性，所以聚胺基葡萄糖中的肝素也可能是其非酵素毒性的作用目標。因此本論文的第一、二部分主要以中國倉鼠卵巢細胞(CHO-k1)，測其洩漏出的乳酸去氫酵素(lactate dehydrogenase, LDH)來研究細胞表面聚胺基葡萄糖(主要是heparan sulfate)對心臟毒素及磷脂水解酵素A2細胞毒性的影響。另外，我們也猜測心臟毒素的毒性可能牽涉某種訊息傳導。由胺基酸序列比較發現，幾乎所有P型心臟毒素在其第二環尖端都有一段PXXP的序列，與蛋白質SH3區域的結合序列相似。如果心臟毒素會與蛋白質SH3區域結合，則許多含有SH3的訊息分子都可能與其作用。因此本論文的第三部分主要利用螢光光譜滴定法，來檢驗心臟毒素與蛋白質SH3區域的結合情形。實驗結果發現:從台灣眼鏡蛇毒中分離出的心臟毒素A3，及從非洲眼鏡蛇毒中分離出的心臟毒素Tg，都對中國倉鼠卵巢細胞有極強的細胞毒性。A3和Tg的30分鐘IC50分別是1uM和0.21uM。而N-PLA2也會毒殺中國倉鼠卵巢細胞，30分鐘的IC50是40.1uM。其毒性順序依次是Tg>A3>N-PLA2。以酵素除去細胞表面的heparan sulfate之後，A3、Tg、N-PLA2的細胞毒性都明顯地下降約50%，表示細胞表面的heparan sulfate的確是其作用目標。而對於用次氯酸鈉抑制聚胺基葡萄糖硫酸化的細胞，A3的細胞毒性明顯地下降，而Tg與N-PLA2的細胞毒性則下降不多，這表示電荷作用在其毒性上佔有不同的份量。在檢驗心臟毒素與蛋白質SH3區域的結合情形上，很遺憾我們發現心臟毒素A3、Tg、A5及其第二環尖端的胺基酸序列都無法與c-Src SH3或Bruton's tyrosin kinase SH3結合。我們推測可能的原因是proline周圍的胺基酸不符合SH3區域的結構，造成空間上的阻礙，而心臟毒素其第二環本身的板狀結構可能也限制了它形成與SH3區域結合所必須的PPII螺旋結構。