Abstract
將由白化的綠豆幼苗所得來之液泡腺核 三磷酸 (Tonoplast ATPase)以二甲基焦碳酸(Diethyl pyrocarbonate,DEP) 加以處理後，導致其水解活性與質子移入作用(Pr-oton translocation) 被抑制。由抑制時間與活性之對數作圖可得到各種DEP 濃度下之似一級反應速率常數(Pseudo-first order rate constant)，進一步可求得此修飾作用(Modification)之二級反應速率常數為11.51/min/mM；另外亦可求得DEP 修飾此ATPase之反應級數(Reaction order)為0.98。在檢定DEP 所修飾之胺基酸殘基時，發現經DEP 處理後的酵素吸收光譜在波長240 nm之吸收值增加最大，顯示DEP 與組胺酸反應之產物N-carbethoxyhistidine 的形成；而當加入此產物回復劑氫氧化氨(Hydr-oxylamine)時，增加之吸收值被逆轉回復。此外，由酸鹼值依賴性(pH dependence)求得被DEP 修飾的胺基酸殘基具有一解離值(pKa) 為6.86，與組胺酸之解離值相似。根據以上的證據可確定DEP 修飾ATPase中之組胺酸殘基。研究酵素動力學特性時發現DEP 並不改變此酵素對受質之解離度(Km)，但卻使最大反應速率(Vmax)降低了，這種現象乃因 DEP 與組胺酸殘基的作用是不可逆反應之故。另外藉研究此修飾作用之化學計量學(Stoichiometry) 顯示在ATPase中胛個組胺酸殘基可被DEP 修飾，但分析後發現其中只有一個組胺酸殘基對此酵素的活性是必須的。此ATPase的生理受質鎂離子腺核 三磷酸可部分保護此酵素免於被DEP 所修飾，由此可知與活性有關之組胺酸殘基是位於ATPase之活化部位(Active site) 中。綜合所有結果可得之結論為Tonopla-st ATPase 中存在一個與其功能有關之必須的組胺酸殘基，而此殘基可能位在此酵素的活性部位中但不直接參與受質的結合。