Abstract
熱休克蛋白70(hsc70),是一個七萬道爾頓的分子監護子.它是一個ATP水解,同時也是一個 結合蛋白.可想而知,水解ATP所釋出的能量可用於所結合的蛋白質的摺疊或解摺疊的過程.這篇論文是以大白鼠的hsc70的重組蛋白去研究這個蛋白質的結構及功能間的關係.第一,使用定點突變法研究與hsc70水解ATP活性有關的 基酸殘基.將天冬 酸改成天冬醯,得到了突變種hsc70(D10N),分析這個突變種顯示它不僅無法被 激發水解ATP的活性,並且也失去了它的內生性水解ATP之能力.而另一方面它對ATP的解離常數是0.3uM,對於S- 的解離常數是5uM.這些都與hsc70相同.顯示hsc70(D10N)這個突變種的缺失的確是發生在ATP水解的過程.另外,我構築而得到一刪去型突變種(Nt-hsc70),它只含有四萬四千道爾頓的 端之ATP水解 區間,並分析其特性,發現它在沒有 出現時水解ATP之活性是 270 nmol/hr/mg,其活性可與hsc70加了 以後所得之活化相比擬.而且, Nt-hsc70的D10N突變種(Nt-hsc70(D10N)),亦只有非常低的ATP水解活性.這個結果顯示hsc70的天冬 酸-10對催化ATP水解而言是很重要的.第二,以螢光光譜學研究hsc70分子中兩個色胺酸殘基的區域性環境.為了解析hsc70分子中兩個色胺酸殘基的內生性螢光,兩個色胺酸分別被置換成其它的 基酸.色胺酸-90被改為白 酸,色 酸-580則被換成苯丙 酸.產生hsc70(W90L)及hsc70(W580F)兩個突變種,經純化後,並分析其特性.這兩個突變種經証明仍保有受 激活之水解ATP的特性,因此使用螢光淬熄法研究這兩個色胺酸殘基的區域性環境.使用的淬熄劑是丙烯醯,碘離子和銫離子.結果顯示,兩個色胺酸殘基都不是暴露在hsc70的表面也不是埋藏在hsc70的疏水性中心□.最後,研究在有或無 或ATP出現時hsc70分子中兩個色 酸殘基的螢光向異性.結果顯示兩個色胺酸殘基的螢光向異性會因某些 的出現而下降,而ATP的出現卻不會改變這兩個色 酸殘基的螢光向異性.