Abstract
核酸銜接蛋白 (integrase protein, IN) 是反轉錄病毒 (retrovirus)生 活史中不可或缺的一種蛋白。目前, 全球正針對反轉錄病毒的核酸銜接酵 素展開一連串的研究熱, 其中央催化區位 (catalytic central domain) 之 X-光繞射結晶結構終於在去年 (1994年) 被解開。核酸銜接酵素在反 轉錄病毒之生活史中所扮演的角色為將反轉錄酵素所反轉錄之 cDNA 銜接 至寄主細胞的基因組中。至今, 較被了解的作用機制大多是在細胞外 (in vitro) 之實驗推測而來 ;從歷年來對核酸銜接酵素的研究可知其銜 接功能可大致分為二個步驟:首先, 將病毒 DNA 之 3'端移除 2 個核甘 酸 (nucleotides); 然後此新產生的病毒 DNA 的 3'OH 端被銜接到標的 DNA (target DNA); 此兩步驟在 in vitro 中似乎可由核酸銜接酵素單獨 完成任務。我們對核酸銜接酵素較有興趣的是想探討核酸銜接酵素是否可 在細胞內 (in vivo) 單獨表現其活性, 抑或須要其他病毒內或細胞內的 蛋白質或輔因子 (cofactor) 才能表現其核酸銜接之功能。為了區別 HIV-1 核酸銜接酵素是否單獨表現作用, 利用 LTR 被定點突變 (site- directed mutagenesis) 過後之 pMLV-K 當做其受質 (substrate),並 且, 核酸銜接酵素被切除的 pMLV-K 與具有 HIV-1 核酸銜接酵素的 pXT1-l-IN 載體 (vector) 共同表現, 用以偵測 HIV-1 在細胞內之表現 能力。在我們初步的實驗結果顯示, 以免疫螢光法追蹤 pXT1-l-IN 具有 之 HIV-1 核酸銜接酵素在細胞中的表現分佈, 發現可以在細胞質和細胞 核中表現。測定單獨 pMLV-K 與 pMLV△IN*(1U3,1U5) 載體經轉化感染細 胞後, 可以 RT 活性測定偵測到病毒的產生。將 pXT1-l-IN 與 pMLV-K 和 pMLV△Ψ△IN*(1U3,1U5) 分別共同轉化感染 NIH/3T3 細胞, 目前得 到可抗 G418 的細胞群落, 預期將可得到各種不同的穩定細胞株。另外, 將 pMLV-K 之包裝訊號切除用以建立一個包裝細胞株, 以期能進一步的偵 測是否經 HIV-1 核酸銜接酵素之核酸銜接作用能包裝產生具有我想要改 造、選殖過的載體的病毒, 而利用此病毒可應用於基因轉殖作用, 理想中 甚至可應用於基因治療。