Abstract
腎調鈣素(Nephrocalcin, NC)是迄今唯一可確定為抑制腎結石產生的蛋白質。其中，醣基約佔10% (Nakagawa et al. 1983)。目前知道NC有四個isoforms; 分別為NC-A, NC-B, NC-C, 與NC-D，此四個isoforms同時存在尿液中，其分類依據為DEAE陰離子交換液相層析所跑出的四個波峰，其導電值為: NC-A(12-22 ms)、NC-B(23-29 ms)、NC-C(30-39 ms)、NC-D(40-45 ms)。研究顯示，NC-A與NC-B的抑制活性最大，而NC-C及NC-D的活性較小 (Mustafi et al. 1994)，而全部都可同時與四個鈣離子結合，但是，A與B四個鈣離子的結合能力一樣強; C和D則與前兩個鈣離子結合較強，而和後兩個較弱 (Mustafi et al. 1996)。NC與鈣離子結合是可逆的反應，其Kd值約為： NC-A與B是1-3’10-7M，C和D是1.5-6.5’10-6M (Nakagawa et al. 1987)。由於一般與鈣離子結合的蛋白質分為可逆與不可逆結合兩種，而可逆結合在核磁共振的結構上有EF-hand的motif (Mustafi et al. 1996)，可是NC的一級結構至今還未被定出，所以，我們無法得知其是否有EF-hand motif。 從免疫螢光染色的研究中發現，NC可在近端腎小管染出，所以NC被推測在此合成，並流入近端腎小管中與尿液混合 (Sirvongs et al. 1989)。同時，NC可在腎癌細胞中大量製造，這對腎癌的檢驗有很大的幫助 (Michaels et al. 1998)。 在抑制草酸鈣生長的研究發現，NC會吸附在晶種電子密度較大的一側，使得晶體的結構會越來越不規則，同時解理會形成片狀且很脆弱，這種不穩定的構造，在正常尿液中很快就會被沖散 (Deganello, 1991)。所以，NC並不是直接抑制草酸鈣結晶形成，而是使其有不穩定的結構，導致生長減緩。但是，如果NC過量的話反而會促進結石的形成，因為過多的NC會使晶體聚集形成結石的核心。在抑制晶體聚集的研究中，NC會保持晶種間的完整性，而不會使晶種彼此聚集在一起 (Asplin et al. 1991)。由這些研究中我們知道，NC可以使晶體生長、吸附減緩，同時還可以避免晶體聚集，進而達到抑制結石產生的目的。 由上可知，腎調鈣素的確是尿液中最重要的一個抑制因子。所以，我們的研究方向就是要更進一步，瞭解其分子結構與反應，把它抑制結石產生的機制作更細微的探討。因此，我們必須要用一個更有效率的方法來大量純化腎調鈣素。所以，我們用了一個簡單又有效率的濃縮方法，大量濃縮尿液。接著使用gel-filtration的液相層析除去絕大部分大分子的蛋白質，最後用強陰離子液相層析得到純度很高的腎調鈣素。最後，我們做胺基酸組成分析，與其他研究者的數據比較，確定為我們要的蛋白質腎調鈣素。 得到腎調鈣素之後，我們進行了一些酵素動力學的實驗。首先，用一些二價金屬離子來與鈣離子競爭結合位置，發現不少離子會促進NC與鈣離子的結合活性，其中我們發現銅等二價金屬離子，十分符合Michaelis-Menton的酵素動力學模型，所以我們判定可能有銅離子的結合處，而且與鈣離子的結合處不相同，但是會增加活性。所以，我們利用銅離子是強氧化劑的特性，加入還原劑使其還原並迅速氧化蛋白質，然後把蛋白質切成兩段。我們從蛋白質電泳中可看到NC被切成兩段，利用peptide-maping 方法，來找出到銅的結合處，並證明NC除了鈣離子以外，還有別的兩價金屬離子結合處。