Abstract
核酸銜接反應(integration reaction)是反轉錄病毒(retrovirus)所表現的重要特徵之一, 也是病毒表現基因產物與複製子代所不可或缺的重要步驟,整個反應過程主要由核酸銜接酵素(integrase;IN)所參與;因此IN的作用機制便成為研究核酸銜接反應的重要標的物。 愛滋病毒( HIV)亦是屬於反轉錄病毒的一員,研究其核酸銜接機制,除了有助於我們對病毒生活史的了解,也可以提供我們 一些對抗愛滋病的資訊與策略。在本研究中,我們首先想要建立一個真核表現系統;用真核細胞來表現HIV IN,我們選用真核表現載體 pXT1,使其在老鼠NIH/3T3細胞株中表現IN蛋白,因為 pXT1載體源自於老鼠白血病病毒 (Mo-MLV)的基因組,較容易在老鼠組織中表現。我們建構了 pXT1-IN及 pXT1-L-IN二種載體來進行真核細胞表現IN基因之研究, 並且初步以免疫螢光方法偵測其表現情形。 接著我們也想知道IN是否能夠單獨在細胞中完成核酸銜接工作,不需仰賴其他蛋白因子的協助;因此,我們需要提供適當的受質到此一真核表現系統中,才能觀察其單獨作用的情形;病毒經過反轉錄過程得到雙股 cDNA 基因組,完整的 cDNA 兩端各具有一段 LTR序列,此序列外側3'端為IN所能辨認之主要受質; 因此,我們可以將已經選殖成功的真核表現載體 pXT1及 pXT1-L-IN,直接對載體上的 Mo-MLV LTR序列,進行定位突變,使其轉變為 HIV IN所能辨識之 LTR序列,才能接受 IN 的作用;在此論文中,我們完成了數種不同突變形式的載體,可充當 HIV IN的受質,除了用來觀察 IN 單獨作用的情形外, 亦可觀察IN對其受質序列的選擇專一性,進一步的實驗工作,我們必須探究所表現IN的活性與其應用性。