Abstract
我們由豬脾臟中分離出拓樸異構 Ⅱ, 含有二種polypeptides, 分子量各為100 kDa, 雖然這二個polypeplides, 其In sisu peplide mapping 之pattern 不同但是由protein kinase C.或myelin basic protein kinase作 P labeling所產生具放射性之peptider的patterns卻完全一樣由這二個polypeptides所產生的抗體Ab 和Ab 都會抑制DNA relaxation反應, 而且這二種抗體分別認識human 拓樸異構 Ⅱ之不同domains。利用所純化出來的拓樸異構 Ⅱ, 我們探討拓樸異構 Ⅱ本身及其相關性質之系列研究結果為:(一). 拓樸異構 Ⅱ之DNA dependent ATPase活性和ATP 本身濃度有關當TATPI≦0.2M 時, ATP 水解之Km值為0.01mM時, Km值和Vm值均變大抗癌藥物VM-26和withangulatin A 均會uncoupling 拓樸異構 Ⅱ之ATP 水解與DNA strand passage。(二). 利用所純化之拓樸異構 Ⅱ, 我們探討一段含有colicin El ori 及human gsp70基因5 ’端之2,3 kb DNA中拓樸異構 Ⅱ之entting sites 利用Sanger method (dideoxy DNA sequencing method) wt stantard, 我們找到並定出12個edtting sites 之位置, 這12個cutting sites 中有10個為A 。(三). 接著我們應用所純化出來的石樸異構 Ⅱ, 以是否會引起topoⅡmediated DNAdamage 之特性去篩選作用在其上的抗癌中藥成分得到withangulatin A Withangulutin A 在低濃度範圍(0.5-1＆10-20 μM)時促進topoⅡmediated DNA damage ; 但高濃時, withangulatin A 則會阻礙拓樸異構 Ⅱ和DNA 的結合這可和withangulatinA 與拓樸異構 Ⅱ之結合的對稱性有關。Withangulatin A 對大白鼠OL細胞的ED 值和mAMSA及VM-26之ED 值相當, 約為50nM而withangulatin A 對DNA 合成的抑制則較VM-26緩和, 50％抑制值為2 μM。(四). 利用會和DNA 結合, 或會和拓樸異構 Ⅱ 之ATP binding domain(s)結合的rengents, 測試它們對TopoⅡmediated DNA damage 反應的影響, 發現具DNA intercalating 性質之reagents(例如: Aetinomycin D 及 accidine orange)對同樣是具DNAinteracting性質之mAMSA 所引起的topo Ⅱ mediated DNA damage的抑制較強, 而結合到DNA minor grcove 之reagent (例如: chromomycin A3 及HOECHST 33342) 對同樣結合到DNA minor groove 之VM-26所引起之topo Ⅱmediated DNA damage之抑制較強, 而可以阻止拓樸異構 Ⅱ與DNA 結合之高濃度withangulatin A 則對mAMSA 及VM-26 所引起的topoⅡ mediated DNA damage的能力相近反應液中再加入red-120 dye可以使由這些抗癌藥的所引起的topoⅡ medinted 之broken DNA重回reunioned form。