Abstract
D 型胺基酸在工業上被廣氾用來當作生產許多抗生素的原料, 近來生產D型胺基酸已由化學合成逐漸轉變為利用微生物酵素生產. D-hydroxyphenylglycine (D-HPG)是其中相當重要的一種 D-amino acid,並且可以依靠由微生物的海茵酉每 (D-hydantoinase)及水解酉每 (N-carbamoyl-D-amino acid amidohydrolase) 經兩步驟由原料 D-hydroxyphenyl hydantoin (D-HPH) 合成. 本論文的研究目標便是其中第二步驟的水解酉每. 實驗第一步進行的是 Agrobacterium radiobacterDH102 hydatoinase 及 ami-dohydrolase gene 的 DNA 序列分析, 讀出的 DNA 序列跟GenBank已知序列比對後, 發現在 noncoding region有一252 bp 的 DNA sequence 來自 A. radiobacter 的另一 amidohydrolasegene (GenBank U59376). 進一步利用得到的 DNA 序列, 設計適當的切點將 amidohydrolase 的 DNA 片段接入供 Escherichia coli 使用的pUC19 質體中, 除了 amidohydrolase 本身的之外, 另外試了 E. colilysC 及 A. radiobacter hydantoinase gene 的 ribosome bindingsite並對 amidohydrolase 其中的 Cys243 及 Cys279 作點突變 (pointmutation), 最後並接到 pQE30 及 pC2 兩種表現系統中, 但這些嘗試最後都沒有能夠達到可以產生大量水溶性 (soluble) 酵素的目標. pAHWT及 pAKWT 沒有大量表現, pHYWT, pHYC243S,pHYC279S, pHYCCSS, 及pQEWT 雖有大量表現但大部分皆為 inclusion body, pC2WT則受限於factor Xa 無法有效作用在 fusion protein 上. 最後一部份的實驗則試圖從 E. coli 菌體中純化 amidohydrolase 酵素, 經過十個步驟後得到 744.7 unit/mg 的 amidohydrolase, 酵素活性的回收率(activityrecovery)約4%.